据程院士介绍，双光子显微镜其实不是新鲜事物，1930年代，M·Goeppert Mayer就提出了双光子吸收跃迁的基本原理；1960年代，激光器的发明使得双光子效应被验证和应用；1990年，Denk，Webb发明了第一台双光子显微镜，至今已有20多年的历史。

　　如今，双光子荧光显微镜是活体动物神经成像的经典方法。双光子成像本身具有高分辨率、高通量(高速)、非侵入、成像深度大等特点，与荧光蛋白以及荧光染料等标记物在细胞中的定位与表达技术相结合，能够在生命体和细胞仍具有活性的状态下对其功能进行动态观察，使得人们可以研究处于生理状态时的动物大脑内的神经元活动。

　　双光子成像技术面临的挑战

　　程院士认为，尽管双光子成像有看得准、看得深、光损伤小等优点，但也存在看活体不准、扫描速度慢、体积庞大无法便携化等缺点。

　　之前在神经科学领域，如果科学家想要对小动物在行为过程中的大脑活动进行成像研究，是采用了一种看起来非常好玩而又黑科技的方式。

　　将虚拟现实与双光子成像相结合，在小动物头部被固定的情况下，在其眼前制造影像，让动物认为自己处在“真实”的环境之中，通过动物四肢在类似跑步机或者鼠标滚球上的运动来模拟其真实活动，以求达到研究神经元在动物行为中所起到的作用。

　但是，这种虚拟现实加头部固定成像的方法，已经遭到许多科学家的质疑。他们认为，头部被固定会使动物在实验期间受到物理约束和情绪的压力，因此无法证明虚拟现实下得到的结果等同于真实环境。

　　更重要的是，许多社会行为，比如亲子护理，交配和战斗，是不能用头部固定的方式进行研究的。如何在动物自由活动的时候，直接对其神经元进行成像，是神经科学家还未能得到解决终极的诉求。

　　所以，开发一种微型荧光显微镜，让其直接固定在自由活动的动物身上成为了解决问题的关键。十多年来，人们经历了微型单光子宽场显微镜；重达25克、且成像速度慢的双光子显微镜等阶段，一直无法攻克微型双光子显微镜需要解决的诸多技术难题。

　　新一代微型化双光子荧光显微镜的性能