对于大多数荧光IHC实验，简单的PBS溶液可以在抗体孵育过程中很好地进行冲洗。在某些情况下，可以添加0.05%的Tween-20来帮助减少背景，但通常是不必要的。

　　二抗可以偶联不同的荧光团，有不同的颜色，绿色红色或蓝色。选择二抗，考虑与一抗的特异性以及需要的荧光颜色。可以一个切片使用多种颜色，通过偶联几个有差异的荧光团的二抗来实现，这些二抗根据宿主来源来区分一抗。像一抗一样，将二抗组合成一个孵育溶液。二抗在室温下避光孵育45分钟，以避免荧光团褪色。

　　荧光核复染剂有助于识别样品中不表达你的兴趣抗原的细胞。一个好的复染剂也可以在你的组织样本内提供一些背景和结构线索。如果你没有使用蓝色通道作为你的一抗之一，你可以在1μg/mL DAPI中孵育你的样本，标记细胞核，持续5分钟。还可以购买含DAPI的封片剂，以节省额外的步骤

微波加热模型如下：加热空玻片直到缓冲液开始沸腾。例如，调整微波炉的功率设置为30%。加热10分钟，观察。应避免剧烈煮沸。如果达到快速煮沸，移开玻片，用新鲜的室温缓冲液重复优化。把功率降低到20%，而不是30%。一旦加热程序被优化，记录下来，以同样的方式执行。

　　为了染细胞核或细胞质抗原，经常需要透化作用。一旦你的组织切片已经冷却，将其置于稀释的去垢剂溶液中，如Tween-20或Triton x - 100，大约5分钟，进行透化处理。这种方式会破坏组织的细胞膜，增加细胞通透性，允许抗体达到细胞内的目标。用PBS冲洗玻片。

　　然后，与正常血清孵育进行封闭，10-15分钟，防止一抗和二抗的非特异性结合。

　　封闭血清中的抗体和其他蛋白 非特异性结合到组织切片上，有效地阻断在以后的步骤中一抗和二抗的非特异性结合。封闭血清可与二抗相同种属或者不相关种属。任何封闭溶液不能含有与一抗同种属的血清，以避免荧光二抗与之结合产生非特异性荧光。

　　选择一抗，基于它与目的抗原的特异性，以及对IHC或免疫细胞化学的适用性。

　　为WB或ELISA设计的抗体可能无法识别在固定组织中交联的目标抗原。针对多个目标的一抗可合并为一种孵育液，前提是它们有不同的宿主来源，因此可以用不同的二抗来检测它们。

　　一抗稀释于PBS或PBS-Tween,与样本孵育于室温下一小时或4oC过夜。对于每个实验，应该包括一个组织切片对照，与一种非特异性同型对照抗体结合，该抗体与一抗的类型相匹配(如果一抗是单克隆抗体)，但不识别目标抗原表位。同型对照有助于区分非特异性的背景荧光，从特定的荧光标记的目标抗原。如果一抗是多克隆抗体，包括一种与非特异性的、种属匹配的多克隆抗体孵育的组织切片。

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　　将盖玻片盖到玻片上，使用适用于荧光显微镜的封片剂来帮助保存样品中的荧光信号。使用足够的封片剂封住盖玻片，注意消除气泡，以免图像变形或模糊。

　　玻片在覆盖盖玻片后晾干，并在显微镜上使用适合每个荧光团的滤镜来显示荧光。你可以用多个滤镜获取同一微观区域的图像，然后将图像合并为多色效果。如果你的组织是厚的，可以用一个共聚焦荧光显微镜来获得更清晰的图像，可以在三维空间中对抗原定位进行旋转。